微生物学実習
マエッキー
【過程】
―培地作製―
1.普通寒天斜面培地,SS寒天培地,MR−VP培地,クエン酸培地の材料を121℃
20分オートクレーブにかける。
2.圧力0、温度70℃以下になったことを確かめてから、軍手をはめてオートクレーブから取り出す。
3.55〜60℃の高温槽に入れる。
4.シャーレの文注。
5.平板寒天培地の作製。
―無菌操作、グラム染色・観察―
1.無菌操作。
2.グラム染色・観察。
―鼻腔常在菌の採取―
1.滅菌ずみの綿棒を取り出し、綿棒を手で持ち、他端で鼻腔内を軽く拭う。
2.材料を血液寒天培地とスタフィロコッカス平板培地bP10上に落とし白金耳でひろげる。
3.37℃で培養する。
―便からの採取―
1.人口糞便材料から白金耳でBTB乳糖寒天培地とSS寒天培地に画線塗抹する。
2.37℃で培養する。
―鼻腔常在菌の観察とブドウ球菌を純培養―
1.平板の観察をする。
2.観察されたすべての種類のコロニーより、それぞれ1コロニーを選び、印を付けて、そのコロニーより菌をとり、グラム染色をする。
3.2.のコロニーのうち、グラム陰性球菌のコロニーから白金耳で釣菌し、継代用の普通寒天斜面培地に接種する。
4.37℃ 培養する。
―便からの試料の観察と純培養―
BTB乳糖寒天培地とSS寒天培地のそれぞれの集落を観察する。
―抗酸菌染色―
1.塗抹、乾燥、固定は単染色・グラム染色と同じ操作。
2.染色。
3.水洗、軽く乾燥。
4.脱色。
5.水洗。
6.後染色。
7.水洗、乾燥、鏡検。
―鼻腔常在菌純培養より―
1.コアグラーゼテスト。
2.薬剤感受性テスト。
3.マンニット・食塩培地。
4.カタラーゼテスト。
―PCR―
1.100μℓの検体洗浄液Tの入った1.5mℓチューブにコロニーをつまようじで釣菌し、充分懸濁する。
2.0.2mℓチューブに第一溶菌液を30μℓ入れ、続いて検体を5μℓ加える。
3.50℃、5分間インキュベートする。
4.第二溶菌液を5分間インキュベートする。
5.60℃、10分間インキュベートし、さらに94℃、10分間インキュベートする。
6.PCR用増幅試薬を10μℓ加える。
7.PCR
8.変性試薬を50μℓ加える。
9.mecA用及びspa用ウェルにハイブリダイゼーション緩衝液を100μℓ加える。
10.増幅産物を各々20μℓ加える。
11.37℃、60分間インキュベートする。
12.洗浄液約350μℓで4回ウェルを洗浄する。
13.酵素溶液を各ウェル100μℓ加える。
14.37℃、15分間インキュベートする。
15.洗浄液約350μℓで4回ウェルを洗浄する。
16.発色試薬を各ウェル100μℓ加える。
17.37℃、15分間インキュベートする。
18.検出液を100μℓ加える。
19、検出。
―便からの試料よりTSI,IMViC,OF試験―
1.各純粋培養菌をTSI、SIM、VP‐MR、SC、OF培地に接種する。
―鼻腔常在菌の結果判定―
1.薬剤感受性テスト。
2.コアグラーゼテスト。
3.卵黄・マンニット培地。
―便からの試料結果判定―
1.接種した菌の性状を調べる。
2.インドールの産生性については、IPA判定後インドール・テストを行う。
―芽胞染色―
1.塗抹、乾燥、火炎固定。
2.5%マラカイト緑液で3〜6分加温染色した後、流水で約30秒水洗する。
3.0.5%サフラニン液で30秒染色し、水洗、乾燥。
4.鏡検。
―鞭毛染色と永久標本の観察・スケッチ―
1.塗抹方法、乾燥、軽く固定。
2.染色。
3.対比染色はある種の菌では菌体が不鮮明であるので5〜10倍希釈。
4、水洗、乾燥、鏡検。
―墨汁染色と永久標本の観察・スケッチ―
1.スライドガラスの一方の端に近く墨汁を一滴おとす。
2.白金耳を滅菌し、ごく少量の菌をとり、のせガラス上の墨汁に菌をよくまぜる。
3.白金耳滅菌。
4.他のなるべく切口のきれいなカバーガラスまたはスライドガラスの一端を墨汁と付着させ、45度位の角度で、ガラスを倒しているのと逆な方向へ適当な早さですべらせ、墨汁の薄層をつくる。
5.そのまま充分に乾かして、鏡検。
―ウイルス接種―
1.検卵。
2.消毒。
3.穿孔。
4.ウイルス接種。
5.培養。
―ウイルスの電子顕微鏡観察―
1.電子顕微鏡観察。
―真菌の観察―
1.永久標本の鏡検。
―解卵―
1.ウイルス接種した卵の気室部を鉛筆の線に沿って火炎滅菌した歯科用ピンセットで開ける。
2.ウイルスの採取。
―ウイルス 赤血球凝集反応―
1.HA反応を行う。